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PLOS Biology | CRISPR技术新应用,中科院生化细胞所李劲松团队等筛选小鼠骨发育中的关键基因

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PLOS Biology | CRISPR技术新应用,中科院生化细胞所李劲松团队等筛选小鼠骨发育中的关键基因

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【摘要】:
中科院生化细胞所李劲松团队等筛选小鼠骨发育中的关键基因

大规模隐性遗传筛查是一种用于鉴定生物过程基因的有效方法。这种策略在低等生物中已经成功,如酵母(酿酒酵母)和线虫(秀丽隐杆线虫)。在哺乳动物生物中,由于它们的二倍体基因组,这种功能筛选具有挑战性。RNA干扰(RNAi)目前用于通过靶向mRNA在哺乳动物细胞中进行基因组规模的功能丧失筛选;然而,这种方法通常不足以抑制基因表达,并对其他mRNA具有脱靶效应。CRISPR-Cas9系统已经应用于小鼠和人细胞中的有效功能丧失筛选。然而,迄今为止,CRISPR-Cas9介导的基因组规模筛选仅在细胞水平上使用,限制了其应用于基于细胞的表型。

从单性生殖或雄激素胚泡中产生哺乳动物单倍体胚胎干细胞(haESCs)为细胞水平的遗传分析提供了理想的工具。雄激素haESCs(AG-haESCs),其基因组来自精子,支持胚胎注射到成熟卵母细胞,活体动物被称为半克隆(SC)动物。此外,携带组成型表达的Cas9和单指导RNA(sgRNA)文库的DKO-AG-haESCs允许一步产生突变小鼠,显示在小鼠的生物体水平上进行功能性诱变筛选的可能性。

2019年7月2日,中科院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)李劲松联合邹卫国团队等人在PLOS Biology上发表题为“Targeted genetic screening in mice throughhaploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”的文章,建立了一种体内遗传筛选策略,以基于ICAHCI技术和CRISPR-Cas9文库的组合应用来鉴定参与骨发育的基因。

研究人员使用Cas9B-3-BD细胞进行ICAHCI实验,产生突变小鼠。试图通过骨骼分析来识别骨骼发育中涉及的关键基因,这些新生SC幼崽可能覆盖69个候选基因。为了测试来自Cas9B-3-BD细胞的所得SC幼崽中的突变率,研究人员分析了3个ICAHCI实验产生的总共39个SC幼崽。sgRNA插入分析表明38只幼崽携带1个sgRNA。

Sanger测序的常规基因分型分析显示其中29个在sgRNA靶向位点携带突变,其中21个携带纯合或双等位基因突变,效率为55.3%,显着高于先前报道的效率30.5%(83/272)。 TIDE或胸腺嘧啶和腺嘌呤(TA)克隆分析显示,21个纯合子或双等位基因突变小鼠中有13个携带框内突变/野生型序列,总序列少于30%。同时,TIDE结果显示12只SC幼崽携带超过2种类型的等位基因,与在Runx2被靶向时的早期观察结果一致。总之,这些结果表明,使用具有靶向sgRNA文库并组成型表达Cas9的Cas9B-3-BD细胞,可以通过ICAHCI有效地产生突变小鼠。

通过产生突变小鼠系验证Rln1和Irx5

诱变筛选对于鉴定参与发育过程的关键基因是有效的。然而,这种筛选仅在低等生物中成功。该研究通过结合雄激素单倍体胚胎干细胞(AG-haESCs)和CRISPR-Cas9技术,在小鼠中开发靶向遗传筛选方法。通过卵母细胞注射携带组成型表达的Cas9的AG-haESCs和指导72个预选基因的单指导RNA(sgRNA)文库,通过骨骼筛选骨发育相关基因,制备突变半克隆(SC)小鼠库。发现了4个基因:骨骼发育所需的Zic1和Clec11a,以及之前未考虑过的Rln1和Irx5。

尽管Rln1 - / - 小鼠仅在出生时表现出较小的骨骼,但骨量减少和骨髓脂肪生成增加,Irx5 - / - 小鼠在出生后和成人阶段都显示出骨骼异常。IRX5通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)活化来促进成骨细胞生成并抑制脂肪形成。因此,AG-haESC介导的功能性诱变筛选为小鼠发育过程的遗传查询开辟了新的途径。

原文链接:

https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000350

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