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贝赛小科普|关于动物模型的那些事(三)

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贝赛小科普|关于动物模型的那些事(三)

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【摘要】:
基因工程动物疾病模型是指某些遗传性状通过基因工程手段而被人为改造的动物。以对动物改造的手段不同可分为三类:转基因动物、基因敲除动物、基因替换动物。


什么是基因工程动物疾病模型?

     

      基因工程动物疾病模型是指某些遗传性状通过基因工程手段而被人为改造的动物。以对动物改造的手段不同可分为三类:转基因动物、基因敲除动物、基因替换动物。

 

 

 基因工程动物疾病模型的分类

 

▶︎ 转基因动物模型

       动物模型是现代生命科学研究的重要工具,特别是基因工程小鼠和大鼠,在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。

 

◆定义    通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚胎细胞中,并能稳定遗传下一代,由此获得的动物称为转基因动物。

◆特点    由于转基因动物模型是将目的基因随机整合到动物基因组中,所以被转入的目的基因能够在全身细胞内得到表达,但该基因整合的位点存在随机性。

 

▶︎ 基因敲除(入)动物模型

       通过基因工程手段将已知基因去除,或用其他顺序相近的基因取代,而获得的工程化动物。通常针对一个结构已知但功能未知的基因,通过观察基因敲除动物的情况,推测相关基因的功能。

<全身性基因敲除动物模型>

       又称完全性基因敲除动物模型,是把相关基因全部敲除,使动物全身细胞均不表达该基因的动物模型。

<条件性基因敲除模型>

       是按照要求来敲除实验动物的基因,使动物某一特定组织或某一特定时期不表达该基因的动物模型。

<定点基因敲入动物模型>

       将目的基因引进特定的位点,使动物原本的基因组发生改变,从而得到的基因敲入动物模型。

 

▶︎  基因替换动物模型

       与某个生理现象相关的两个基因中,一个基因的编码区被另一个基因的编码区取代的工程化动物模型。

<点突变动物模型>

      将动物基因组中某一指定基因上的单个碱基使用其它碱基替换,造成位点突变,导致动物原本的基因组发生改变,从而得到点突变动物模型。

<片段置换动物模型>

       将动物基因组中某一指定基因片段使用其它基因片段替换掉,导致动物原本的基因组发生改变,从而得到的片段置换动物模型。

 

 

不同基因工程动物模型的比较

 

 

 

 

 技术支持

 

▶︎ 核心应用技术① —— PiggyBac转座子系统

<Tips>操作简单,可承载的基因片段大,无需包装慢病毒

    PiggyBac(PB)转座子来源于鳞翅目昆虫,最初是在研究杆状病毒(Baculovirus)侵袭粉纹夜蛾细胞系TN-368时首次发现并分离到的。在分类上属于真核生物的第二类转座子,是一个自主因子,长2 476 bp,有短的末端反向重复序列(ITR)和一个开放编码框(ORF),ITR长13bp,ORF长2.1kb。PB转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座。

       PB系统转座效率高,宿主范围广,研究发现PB系统在哺乳动物及其细胞中也具有高效的转座活性,故近年来,该系统被大量应用于转基因动物的制备当中,已在动物基因组功能研究、基因转移及诱导多能干细胞等领域得到了广泛应用。

 

(图片来源:@冻春卷 from简书)

 

▶︎ 核心应用技术② —— CRISPR/Cas9基因编辑技术

<Tips>周期短,但存在马赛克现象和脱靶现象

      CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制,是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。

       CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑, 目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备,其原理也是对目的片段产生特异的切割后,修复过程中产生移码突变或者是片段缺失,或者是在切开位置产生片段插入等现象。

 

 

 (图片来源于网络)

 

 

 

 CRISPR/cas9技术与其他基因修饰技术对比

 

 

 

▶︎ 核心应用技术③ —— 显微注射技术

       显微注射是一种常用的转基因技术,能将外源基因直接注射到受精卵原核内,对DNA片段大小无限制,无需载体,可获无载体片段的转入目的基因,操作简单,周期短。利用显微注射可以实现将目的基因整合到小鼠受精卵的基因组中,并稳定遗传给后代。

       该技术目前广泛应用于制作基因编辑动物、转基因模型动物当中,并起到了不可泯灭的作用。

 

 

 

主要实验流程

 

(以全身性基因敲除动物模型为例)

 

 

 

 

 

A:建立基因工程动物模型的优点有哪些?

Q:以小鼠为例,由于小鼠与人类在生理学方面比较相似,小鼠突变表型接近人类遗传病的表型,且小鼠基因与人类基因的相似度可达99%;小鼠基因组序列和连锁图已经比较清晰,遗传背景也相对稳定;并且小鼠的繁殖速度快,每窝产仔数多,方便对照实验。

     通过建立基因工程动物模型,主要是通过阻止、改变或增加特定基因在动物体内的表达,从而来研究基因结构与功能、建立人类疾病动物模型,尤其是遗传病模型、研究各种药物的作用机制和药效学。

 

(图片来源于网络)

 

  

部分基因工程动物模型列举

 

◆ DBDB小鼠模型:(Lepr基因敲除小鼠)

        DBDB小鼠(C57BL/KsJ)小鼠是Leptin受体点突变导致leptin信号通路障碍,从而导致dbdb小鼠出现肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝等症状。是由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来,属Ⅱ型糖尿病模型。动物在一个月时开始贪食及发胖,继而产生高血糖、高血胰岛素,胰高血糖素也升高。DBDB小鼠一般在10个月内死亡。糖尿病DBDB小鼠(C57BL/6Jdb/db)发生严重的糖尿病症状,类似C57BL/KsJ ob/ob小鼠,即早发的高胰岛素血症,体重下降和早死。

 

◆ ApoE小鼠模型:(ApoE基因敲除小鼠)

       ApoE基因敲除(ApoE-knockout,ApoE-/-,ApoE-deficient)小鼠是迄今为止作为高脂血症(高血脂, hyperlipemia, hyperlipidemia)模型复制的最理想的小鼠,也是基因工程小鼠中使用最广泛和研究比较深入的小鼠。基于不同母本(野型,Wild type)敲除ApoE(lipoprotein E)得到不同的ApoE-/-小鼠。最常用的是基于C57BL小鼠作为母本进行的ApoE基因敲除。

 

◆ AD小鼠模型:(APP/PS1转基因小鼠)

        APP/PS1小鼠(AD)双转基因的小鼠可表达突变的人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样前蛋白(APPswe)融合体,APP/PS1(AD)双转基因小鼠这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。人类早老素基因的DeltaE9突变是该基因的第九个外显子缺失产生的,此突变会导致早发性老年痴呆症。

 

◆ NVSG小鼠模型:(rkdc基因exon 37&Il2rg基因exon3-4双敲除小鼠)

         NVSG小鼠缺乏成熟的T、B、NK免疫细胞,补体活性降低,巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱,可高效地移植人造血干细胞(HSC)、外周血单核细胞(PBMC),患者来源的异种移植物(PDX)或成体干细胞和组织,是目前公认的免疫缺陷程度高,用于肿瘤、免疫、自身免疫性疾病、免疫治疗疫苗、GvHD/移植、安全性评估等研究的优秀模型。

 

 

 

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