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基因敲除细胞系:如何设计gRNA高效KO

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基因敲除细胞系:如何设计gRNA高效KO

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【摘要】:
基因组编辑是一种理想的研究基因功能的方法。它可以精确地识别和定位基因组中的特定序列,然后改变目标序列以达到各种目的。CRISPR/Cas9系统由于其简单的机制已经成为当今世界基因组编辑的代名词。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常见的应用。

 

基因组编辑是一种理想的研究基因功能的方法。它可以精确地识别和定位基因组中的特定序列,然后改变目标序列以达到各种目的。CRISPR/Cas9系统由于其简单的机制已经成为当今世界基因组编辑的代名词。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常见的应用。

在CRISPR/Cas9介导的基因敲除实验中,Cas9核酸酶在gRNA的指引下,打靶目的基因,并产生双链DNA断裂(DSB)。由于DSB的不完全修复而产生插入和缺失(indels),引起移码突变,导致终止密码子提前,实现编码基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9实验中,gRNA的选择将很大程度上影响项目的成功率。在选择gRNA的时候,有几个因素可以帮助大家选取有效的gRNA以产生成功的敲除:1)预测gRNA效率;2)选择脱靶风险低的gRNA;3)同时使用多个gRNA以提高敲除效率。在编码基因敲除实验中, DNA水平验证KO结果是首要的,此外,蛋白质水平的验证也非常关键。蛋白水平的验证通常是通过Western Blot实现的,但以下这两种现象,有可能导致截短蛋白仍然表达,从而致使WB验证时出现阳性情况。

  • (1) 基因产生移码突变后,下游ATG密码子有可能启动翻译,从而导致蛋白表达。或者位于移码突变上游的外显子翻译表达,产生N末端截短蛋白。
  • (2) 细胞跳过被编辑的外显子翻译表达,产生内部序列缺失的蛋白质异构体。

图1: 抗INDEL效应导致CRISPR基因敲除实验失败的细胞机制

 

 

翻译重新启动

CRISPR介导的基因敲除通常是通过Cas9产生dsDNA断裂来实现的:在切割之后,非同源末端连接(NHEJ)的易出错性质会导致在切割位点有一个或多个核苷酸的插入或缺失(indels),从而引起移码突变,终止密码子提前,并产生无义介导的降解(NMD), 从而完全敲除基因。因此打靶位点常常选择尽量靠近开放阅读框(ORFs)5′端。然而,这个策略往往会忽略ORF内的存在ATG启动另一个ORF并翻译成截短型蛋白的可能。已经有不少文章报道过这种非法翻译(ITL)蛋白,它是与人类疾病相关的遗传因素。因此,基因编辑介导的阅读框外的突变可能会导致非法翻译,从而表达可被抗体识别的截短型蛋白质。

图2: 翻译重新启动的机制

 

 

外显子跳跃

最近,Mu等人报道,利用CRISPR和单个sgRNA,在细胞系中打靶外显子,可以通过以下两种机制产生外显子跳跃:第一种是在突变的前体mRNA剪接过程中发生的;第二种是由于基因缺失导致多个外显子和其余外显子剪接。

已知跳跃多个外显子的机制是:基因缺失后,完整的外显子被剪接。更复杂和令人关注的是,只有一到几个核苷酸的突变才会导致前体mRNA剪接过程中外显子跳跃。除了内含子-外显子边界的剪接位点外,外显子还包含对剪接效率起积极或消极作用的序列。外显子内起正作用的元件,称为外显子剪接增强子(ESEs),与识别增强剪接机制的因子结合。起负作用的元件称为剪接沉默子(ESSs),它被认为是抑制废置剪接位点的使用。因此,我们可以假设indel通过破坏ESE或偶然引入ESS来促进外显子跳跃。这些机制将造成被打靶外显子缺失的截短型ORF的表达,从而干扰WB验证结果及后续功能实验。

图3: 外显子跳跃的机制

 

那我们该怎么做?

对KO实验进行严格的质量控制是十分重要的,以确保构建的基因敲除细胞不包含隐藏的“惊喜”。理想情况下,我们可以事先预测如何打靶一个基因来避免外显子跳过的问题。在设计KO项目之前,可以做以下实验,以帮助制定避免上述蛋白残留的问题的打靶策略。

  • 1. 具有跳跃能力,如果有,则测定蛋白质编码潜能。例如,分别设计引物,识别位于潜在跳跃外显子上下游的外显子,以及目的外显子,通过比较RT-qPCR结果,我们将能够判断是否发生了外显子跳跃,以及它是否会影响基因敲除结果。
  • 2. 翻译形式检测。在抗体特异性很高的前提下,WB结果中如果出现预期的条带,以及在不同分子量(MW)处有其它杂带,这表明这个基因存在蛋白质异构体。根据大小,并结合上述RT-PCR结果,可初步判断编码异构体的ORF。结合质谱分析则可以进一步确认异构体的存在及来源ORF的构成。

 

如何设计有把握的gRNA?

在设计gRNA时,除了常规的参数(靶向效率和脱靶效应),应根据数据库、文献、上述qPCR、WB等检测结果来判断靶基因的潜在的多个转录本、ORF、起始密码子位置、外显子大小和是否不对称外显子,来选择要打靶的位点或区域。比如,如果存在截短型ORF及非法翻译,则大靶位点应该保证同时会破坏这些ORF;如果存在外显子跳跃,则应该避开靶向被条约的外显子;如果因为存在多个ORF、外显子跳跃而无法设计有效的移码策略,则应该考虑采用大片段敲除或直接破坏启动子等策略进行敲除。

总之,CRISPR技术的正确使用始终取决于仔细的实验设计、执行和分析。为一个实验选择gRNA需要平衡最大化打靶效率和最小化脱靶效应,同时想获得无蛋白残留的KO细胞,则必须在gRNA设计阶段综合考虑各种因素,确认最优方案。

 

武汉贝赛模式生物科技有限公司提供基因编辑(转基因、基因全敲、条件性敲除、基因敲入、点突变等)大小鼠模型,提供定制的基因编辑细胞系构建服务(基因敲除,点突变,基因敲入),进行动物相关实验(大小鼠净化、精子及胚胎保种等),提供模式动物繁殖供应和药物药效评价以及新药研发服务等。